折射率作為制藥中液體的質量控制指標

本文介紹了采用四種分析系統（pH、電導率、滲透壓和折光率）對九種緩沖液進行分析案例比較。

介紹

制藥產品的研發和制造涉及的復雜過程需要先進的過程分析技術，即使是常規應用。此要求適用于不銹鋼和玻璃容器中的大規模制造工藝以及一次性袋子系統。從培養基和緩沖液制備到滅菌和去污染物的過程都需要液體化學濃度、溫度監測和控制，以確保最佳的工藝性能。任何這些步驟的錯誤都可能導致昂貴的產品損失、產品質量下降或時間和勞動力損失。然而，雖然任何制藥生產過程中的每一步都代表著代價高昂的潛在錯誤的來源，但大多數步驟也可以用作潛在的質量控制點。因此，密切監控制造過程中的關鍵步驟是良好制造工藝設計的關鍵部分。

對液體化學品進行有意義的質量控制需要可靠、易于使用、高精度和快速響應時間的分析儀器。目前滿足這些要求的在線方法包括pH、電導率和滲透濃度。簡而言之，滲透壓濃度是溶質濃度的量度，定義為每升溶液中溶質的滲透摩爾數。所有這些可用技術都面臨著動態范圍、線性度、精度以及檢測限（LOD）和定量限（LOQ）的限制。此外，這些方法都不是液體化學濃度的必不_可少的測量。在這里介紹的工作中，介紹了一種基于折射率（IoR）的新儀器，并與pH，電導率和滲透濃度進行了比較。由于作為濃度監測器的導電性特別高，因此要特別注意比較IoR和電導率測量結果。

折射率測量比pH和電導率具有優勢，因為IoR是化學濃度的直接測量值，而pH和電導率取決于流體的電_子特性。因此，根據定義是化學濃度的間接或推斷測量。在制藥生產中，IoR可用于上游和下游應用，而此處介紹的結果主要集中在下游緩沖液制備應用中。傳統的折光儀通過將單一波長的可見光照射到與被分析流體接觸的棱鏡上來工作。流體的loR是使用斯涅爾定律從臨界角確定的。對于大多數液體，簡單的校準將loR值轉換為以ppm或重量%為單位的化學濃度。傳統折光儀的局限性在于它們在透射模式下工作，其中光通過流體傳播到光學光檢測器。這種方法的缺點是光信號受到流體的衍射和吸收效應的影響。本研究中使用的IoR分析儀在反射模式光學幾何下運行。這意味著光從光學窗口的背面（與被分析的流體接觸）反射到光學光檢測器中。通過這種方式，減輕了濁度、衍射和吸收的德羅加-托里流體效應，并且可以方便地測量不透明流體的濃度。

雖然任何制藥過程中的每一步都代表了代價高昂的錯誤的潛在來源，但大多數步驟也可以用作潛在的質量控制點。

為了探索IoR作為質量控制指標的有效性，進行了一系列實驗，涉及測量已知濃度的常用緩沖液成分和溶解在水中的細胞培養基成分。將 IoR 測量值與 pH 值、電導率和滲透濃度測量值進行比較。從這些實驗中確定，通過IoR測量在準確性，精密度，線性，可檢測極限（LOD）和定量限（LOQ）方面提供的數據優于當前測量溶液電導率，pH和滲透壓的方法。LOD被定義為與空白值（一西格瑪）相比可以測量的物質的最_低濃度。在這項研究中，LOQ與LOD的區別在于，在十西格瑪的可靠性下可以確定的最_低濃度。

實驗方法

對pH、電導率、滲透濃度和折射率（IoR）進行了比較，以確定常規液體化學濃度測量的最佳方法。測量是在紐約錫拉丘茲工廠進行的。pH、電導率和IoR測量都是在線實時進行的。使用離線取樣進行滲透壓濃度測量。電導率、pH和滲透壓濃度是根據其在行業中的常見用途選擇的，并作為IoR分析儀的基準。

每種技術在不同的操作原理下運行。電導率是電解液或水溶液中每單位距離電導率的測量值，其測量低導電性或非導電性液體的能力受限。溶液的pH值是溶劑化氫離子（H+）活性的量度。滲透壓濃度是每升溶液的滲透摩爾數。這里使用的具體方法是“冰點降低"滲透濃度，其中冰點的差異作為添加到溶劑中的溶質的函數產生溶液的濃度值。冰點降低滲透壓濃度作為一種響應時間相對較長的離線實驗室技術受限。

折射率是一種光學技術，是溶液濃度的直接測量。本研究中使用的IoR裝置在反射幾何測量中運行;這意味著光從光學窗口的背面反射出來，在分析下與溶液接觸并進入光電探測器。這種幾何形狀的優勢是，IoR分析儀可以監測溶液的電子密度，而不會受到濁度、衍射和吸收等其他光學效應的干擾。此外，IoR 儀器在單個探頭中包括溫度測量，從而提供兩個關鍵過程參數（濃度和溫度）的測量。

IoR、電導率和pH測量是連續進行的。將pH和電導率探頭放置在流體池中，緩沖化學品在閉環中循環。滲透壓濃度測量是離線進行的。制藥生產中使用的緩沖液組分被連續添加到各種溶液中。對于溶質的每次增量添加，將折射率的測量值與電導率的測量值進行比較，并比較兩種測量方法的數據的準確性，精密度和線性。文中使用的緩沖成分包括添加劑1。氯化鈉加入含有固定濃度磷酸鈉的溶液中，2.檸檬酸鈉加入到固定濃度的磷酸單鈉溶液中，3.磷酸單鈉添加到氯化鈉中，4.檸檬酸鈉加入磷酸鈉，5.HEPES添加到氯化鈉中，6.將聚山梨酯80加到水中，7.將Triton X-100加到水中。HEPES，4-羥_乙_基哌_嗪乙磺酸，是一種廣泛用于細胞培養的有機化學緩沖劑。選擇這七種緩沖劑是為了更好地代表傳統的鹽緩沖劑和預計將在下游過程中實現越來越多的使用的更新緩沖劑。對pH值為7的50mM（mM=milliMolar）HEPES溶液進行了檢測極限（LOD）和定量極限（LOQ）測量，其中逐漸加入等分的氯化鈉。在這些實驗中，IoR與電導率、pH值和滲透濃度進行了比較。LOD和LOQ值是根據響應的方均差和每個儀器響應的斜率作為濃度變化的函數計算的。在一組單獨的培養基制備實驗中，分析了幾種化學物質，比較IoR儀器和電導率。其中包括HAM F10、Dulbecco MEM、RPMI 1640、酵母提取物和其他培養基化學品。

圖1.折射率分析系統。分析儀傳感器頭包含一個小型化的光學傳感器，該傳感器與所分析的液體化學品接觸。

結果解析

圖1是這些研究中使用的IoR分析儀的圖像。分析儀由兩個流體單元（一個流體單元用于冗余）和數字控制電子設備組成。流體池包含一個小型化的IoR傳感器和熱電偶，與所分析的液體化學品接觸。數字電子盒對原始光信號、IoR 的實時溫度濃度進行分析，并輸出 IoR 或液體化學濃度。圖2至圖5是代表本文研究的所有緩沖液制備過程的結果的數據圖表。圖2顯示了本研究中為混合緩沖鹽溶液而獲得的典型數據示例。圖中，pH、電導率和IoR與NaPO4（磷酸鈉）濃度的關系圖。通過將 20 mM 的 NaPO4 加標添加到 1 升 NaCl（鈉溶液）中 10 次以達到氯化鈉中 200 mM 磷酸單鈉的總濃度來進行測量。pH值對NaPO4濃度變化的響應不足。電導率和IoR均對NaPO4濃度變化表現出出色的響應。與其他緩沖液化學品一樣，IoR表現出比電導率更高的線性度，并且與電導率的R2值0.98相比，最小二乘（R2）擬合置信度為1.00。在所有測試的緩沖溶液中，IoR 的線性度都較高。

圖2.顯示了折射率（右側縱軸）以及電導率和pH值（左側縱軸）與磷酸鈉濃度（以mM為單位）的關系。將10個20mM磷酸鈉濃度加標到1L氯化鈉溶液中。

圖 3 顯示了 pH 值、電導率和 IoR 與 HEPES 濃度的函數關系。pH和電導率都不能有效地監測HEPES濃度。電導率數據與HEPES濃度呈線性關系;但是，斜率為負。為了獲得適當的電導率響應，電導率應隨著HEPES濃度的增加而增加。負斜率可以解釋為，隨著HEPES濃度的增加，溶液的離子變得越來越少，因此電導率降低。對于適當的濃度響應，人們可以預期隨著HEPES濃度的增加，電導率值也會增加，就像圖2中的鹽溶液一樣。因此，電導率無法測量HEPES濃度，因為HEPES是一種非離子溶液，電導率探頭在整個HEPES濃度范圍內提供了錯誤的HEPES濃度讀數。電導率也無法測量聚山梨酯80和Triton X-100。IoR在所研究的整個濃度范圍內以高度線性測量HEPES濃度。

圖3.顯示了折射率（右手垂直軸）以及電導率和pH值（左手垂直軸）輸出與HEPES濃度（以mM為單位）的關系。將六個20 mM的HEPES濃度加標添加到氯化鈉溶液中，使NaCl中的HEPES總濃度為120 mM。

圖4顯示了IoR和電導率與聚山梨酯80（P80）濃度的函數關系。將 P80 以 1 mL 加標添加到 1 L NaCl 溶液中。電導率無法測量P80濃度。相比之下，IoR在聚山梨酯80的整個濃度范圍內顯示出高線性。圖5顯示，IoR對Triton X-100的表現同樣出色，并且電導率無法測量Triton X-100濃度變化。

圖4.折射率和電導率繪制為添加到 1 升 NaCl 溶液中的聚山梨酯 80 （P80） 濃度加標的函數。電導率沒有響應，無法測量P80濃度。

圖5.折射率和電導率繪制為添加到 1 升 NaCl 溶液中的 Triton X-100 濃度加標的函數。電導率沒有反應，無法測量Triton X-100濃度。

表A顯示了此處研究的緩沖溶液濃度測量的IoR和電導率結果的摘要。折射率顯示出高線性度，能夠測量整個動態范圍的所有測試緩沖溶液。電導率測試方法無法測量七個緩沖過程中的五個。此外，IoR 的濃度測量精度為 ±10 ppm，而電導率的濃度測量精度為 ±100 ppm。

表A.緩沖溶液濃度測量的IoR和電導率結果摘要。

圖 6 顯示了此處評估的每種技術的 LOD 和 LOQ。這些結果表明，IoR分析儀在電導率、pH和滲透濃度方面具有強大的優勢。對于IOR分析儀，LOD和LOQ分別為0.70和2.33。電導率LOD和LOQ比IoR分析儀器差兩倍以上，分別為1.76和5.84。

圖6.用于 pH、電導率、折射率和滲透壓濃度測量的檢測限 （LOD） 和定量限 （LOQ）。

圖7顯示了培養基制備過程中酵母提取物的IoR分析儀和誘導率的比較。IoR分析儀顯示出優異的電導率線性。此處評估的所有其他培養基制備過程均有類似的結果。

對于所有實驗，使用折射率（IoR）分析儀測量的溶質濃度在線性（通過數據生成的線的R2測量值）、精度、準確度（確定的最佳最小二乘線性擬合）、動態范圍和重現性方面優于電導率測量。總結：

• 為了測量連續添加NaCl到恒定溶液[NaPO4]中，IoR的濃度測量表現出優異的線性和精度（通過R2值測量）。

• 為了測量將 NaPO4 連續添加到常數 [NaCl] 溶液中，IoR 測量表現出卓_越的線性度和精度（通過 R2 值測量）。

• 為了測量HEPES連續添加到恒定[NaCl]溶液中，IOR的濃度測量表現出卓_越的線性，精密度和特異性。由于向溶液中添加HEPES的電導率產生的線斜率大部分是平坦的，實際上略有負值，因此電導率測量對緩沖溶液中的HEPES幾乎沒有特異性。

• 為了測量檸檬酸鈉連續添加到恒定 [NaPO4] 溶液中的測定，IOR的濃度測定顯示出遠超的線性（電導率測量是非線性的）、精度和范圍。

• 對于連續添加聚山梨酯 80 到水中的測量，IoR 的濃度測量表現出卓_越的線性、精密度和特異性。

• 對于針對 pH、介導率和滲透濃度的 LOD 和 LOQ 實驗，對于定量限和檢測限，IoR 的靈敏度是電導率的 2.5 倍，是滲透濃度的 4.2 倍，是 pH 的 28.6 倍。

• 對于連續增加的復雜介質濃度，通過IoR進行測量表現出優異的線性度和精度，生成的數據的R2值更高。

圖7.折射率 （IoR） 和電導率繪制為酵母提取物的函數（以克為單位）。IoR分析儀表現出優于電導率的線性。

討論

這些實驗表明，與pH值、電導率和滲透壓相比，通過折射率測量工藝流體是制藥制造中實時、在線質量控制的可行和卓_越的手段。此外，實驗表明，目前可用的基于IoR的設備比目前可用的測量其他流體參數（如電導率、滲透壓濃度和pH值）的流體測量設備表現出更大的線性和精度，以及更低的可檢測性和定量水平。他們還表明，與電導率和pH值相比，通過折射率測量顯示出更大的特異性和相關性，用于測量含有它們的任何緩沖液或生長介質中陰離子溶質的濃度。由于非離子溶質不影響電導率或pH值，因此在測量制備溶液中此類溶質的含量時，這些特性的測量提供的信息很少。此外，含有兩性離子（偶極離子）的溶液（如HEPES）的行為是高度不可預測的;因此，使用pH和電導率來測量兩性離子溶液成分的濃度也不是最佳的。這些屬性（非離子溶液和含有兩性離子（偶極離子）成分的溶液具有卓_越的精度、線性和特異性，使得折射率測量適用于制藥生產中必不_可少的許多緩沖液和細胞培養基的質量控制。

此外，IoR 也可能是驗證發酵和分離罐的在線清洗 （CIP） 解決方案的高度相關指標。與電導率的比較尤其基于對改進實時、原位濃度監測和控制的需求。事實上，在幾乎所有情況下，IoR都是用于濃度測量的優于電導率的方法。

然而，傳統的IoR受到其無法指_定化學混合物的限制。因此，近紅外（NIR）和傅里葉反式紅外光譜（FTIR）等吸收光譜技術是用于復雜化學混合物的強大集中形態分析工具。

通過 IoR 進行測量還有其他優勢。由于折射率測量只需要一束從工藝流體表面反射的光。因此，它有效地消除了流體采樣造成的任何潛在污染風險，或由于施加電壓電位或其他測量方式而對敏感介質內容物的潛在損壞。此外，折射率測量幾乎是瞬時的，而其他方法（如采樣）需要更多時間。測量折射率也更有可能減少人為誤差。

這并不是說折射率測量與其他質量控制指標相比沒_有_缺_點。具體而言，傳統的IoR測量多組分流體混合物的平均濃度，并且缺乏指_定所述混合物中特定組分濃度的能力。IoR 也取決于溫度，最_先進的 IoR 分析儀具有實時溫度補償作為內置功能。不能推斷折射率測量在所有情況下都應取代pH、電導率或滲透濃度的測量。相反，pH值雖然目前是一個不太準確的測量指標，但它仍然是流體的物理特性，其本身會對產品質量產生非常直接的影響。溶液的滲透濃度或電導率也可能直接影響產品產量和質量;但是，并非在所有情況下都是如此。事實上，鑒于許多緩沖液和營養培養基的關鍵成分是陰離子的，因此，對電導率完_全沒有影響，因此很容易爭辯說，在這種情況下，折射率將是一個與整體產品質量更直接相關的指標。

同樣，兩種非常不同的溶質的等摩爾量可以產生相同的滲透壓濃度讀數，因此滲透壓濃度測量無法檢測到兩種溶質之間的差異。這兩種不同的溶質不太可能給出相同的滲透壓濃度讀數，也不會給出相同的IoR讀數。因此，對于許多應用，工藝流體折射率的測量很可能可以替代其他指標，而對于其他應用，它更恰當地可能是通過其他物理參數進行測量的補充。在許多情況下，額外的指標可能是保障產品質量和產量的關鍵指標。

IoR作為過程質量控制指標的其他應用仍有待研究，但可能具有巨大的潛力。折射率的卓_越靈敏度可能使其在測量最終產品的濃度和/或質量方面具有潛在價值。不太可能是折射率檢測內毒素等雜質的能力。在制藥領域之外，IoR也可能是一個有益的指標。IoR 的其他應用包括相關行業，如微芯片制造、塑料、食品加工、釀造、釀酒和化妝品。但對于所有這些應用，IoR 將提供相同的功能——與電導率測量相比，具有更高的精度、精度和線性度。